PCR test

Maximilian Reindl je študiral kemijo in biokemijo na LMU v Münchnu, od decembra 2020 pa je član uredniške ekipe Seznanil se bo z medicinskimi, znanstvenimi in zdravstvenimi temami, da bodo te razumljive in razumljive.

Več objav avtorja Maximilian Reindl Vse vsebine preverjajo medicinski novinarji.

PCR testi so postali nepogrešljiv del sodobne medicine in molekularne diagnostike. Ker so tako natančni, veljajo za "zlati standard". Uporabljajo se lahko v številnih aplikacijah, od odkrivanja patogenov do presejanja dednih bolezni - torej povsod, kjer je treba zanesljivo odkriti tudi najmanjše sledi dednega materiala. Tukaj ugotovite, zakaj je test PCR tako natančen, kje se uporablja in kako natančno deluje.

Kaj je PCR test?

PCR test je laboratorijska metoda iz molekularne biologije in medicine. Test se uporablja za neposredno odkrivanje - in karakterizacijo - genskega materiala. Strokovnjaki menijo, da je metoda PCR enostavna za izvajanje, univerzalno uporabna in robustna.

V laboratoriju je PCR test sestavljen iz dveh korakov. V prvem koraku se obstoječi genski material reproducira s pomočjo verižne reakcije s polimerazo ali na kratko PCR. Na ta način je mogoče pregledati najmanjše sledi DNK. To je tudi razlog, zakaj so testi PCR tako občutljivi.

V drugem koraku se genski material loči, "razvrsti" in tako označi glede na njegove lastnosti. Tako se določi fina struktura DNK.

Obstaja veliko možnih načinov uporabe: zdravniki s PCR testom pregledajo na primer brise za koronavirus, krvodajalstvo za HIV ali pregled novorojenčkov za možne dedne bolezni. Bakterijske okužbe - na primer s povzročiteljem tuberkuloze - ali parazitske okužbe (malarija) je mogoče razjasniti tudi s PCR.

V sodni medicini pomagajo tudi obsoditi storilce kaznivih dejanj na podlagi njihovega genetskega prstnega odtisa ali pa se uporabljajo kot testi očetovstva.

Vse te aplikacije so povzete pod izrazom molekularna diagnostika. PCR tako najde praktično uporabo v raziskavah, diagnostiki in forenziki daleč od odkrivanja patogena Sars-CoV-2.

(Corona) PCR test v primerjavi s hitrim PCR testom

Običajno ocena PCR testa poteka v specializiranem laboratoriju. To pomeni, da se vzorčni material pošlje in pregleda. Rezultat običajno dobimo nekaj dni kasneje.

Različni zagoni (GNA Biosolutions, Spindiag) so pred kratkim predstavili nove vrste mobilnih testnih naprav. Za to so prejeli tudi posebna dovoljenja Zveznega inštituta za zdravila in medicinske pripomočke (BfArM). S pomočjo teh mobilnih naprav za testiranje PCR bi bil test PCR mogoč tudi brez specializiranega laboratorija.

Ta pristop ima velik potencial, saj bi bil lahko zanesljiv rezultat testa v nekaj urah na voljo neposredno na mestu, kjer je bil odvzet vzorec (preskusni center).

V kolikšni meri bodo v praksi prevladovali tako hitri preskusni sistemi PCR, še ni mogoče oceniti. Prav tako še ni znano, kako hitro bodo preskusni centri opremljeni s temi napravami.

V bližnji prihodnosti se bodo zato še naprej izvajali "redni" laboratorijski testi PCR, ki povzročajo določeno zamudo med vzorčenjem in rezultatom testa.

Kako zanesljiv je PCR test?

PCR je dokazana metoda odkrivanja v molekularni diagnostiki in medicini. Velja za tako imenovani zlati standard z zelo nizko stopnjo napak. Za teste je značilna zelo visoka občutljivost in specifičnost.

Občutljivost pomeni zanesljivost, s katero test najde genetski material, ki ga je treba odkriti.

Posebnost pomeni gotovost, s katero test ugotovi, da zadevni genetski material ni v vzorcu.

Kdaj testi PCR delujejo v primeru okužbe s Sars CoV-2?

PCR test praviloma odkrije okužbo s korono dva do tri dni pred in do 20 dni po pojavu simptomov. Tudi pri okuženih ljudeh, ki ostanejo popolnoma brez simptomov, test deluje v kritičnem časovnem obdobju, ko lahko okužijo druge.

V posameznih primerih je to mogoče celo 60 dni po pojavu simptomov bolezni.

Prvi dan po okužbi s korono je lahko tudi test PCR negativen, čeprav je prisotna okužba. V takem primeru v času testa brisa v grlu ni bilo dovolj virusov. Če pa obstaja utemeljen sum na okužbo, zdravniki v naslednjih dneh običajno opravijo še en test PCR.

možni viri napak

Stopnja napak v procesu kopiranja DNK je v praksi zanemarljiva. Čeprav DNA polimeraze nikoli ne delujejo pravilno, v procesu testiranja PCR komaj igrajo vlogo.

V praksi so možni viri napak v postopku vzorčenja: Zato je pomembno, da usposobljeno medicinsko osebje opravi brise. Vzorci sline in grgranja bi lahko zmanjšali natančnost, saj se tukaj pojavijo učinki redčenja.

Kako deluje PCR test?

PCR test opravi na primer družinski zdravnik ali v posebnih testnih centrih. Najprej odvzamejo zdravniki ali usposobljeni zdravstveni delavci. Običajno se za test vzame bris z zgornjih dihalnih poti. To je običajno v obliki brisa iz ust ali nosu in grla.

Možno je tudi grgranje z raztopino za izpiranje. Vzorec krvi je netipičen za odkrivanje korone - vendar je razširjen, na primer pri presejanju novorojenčkov.

Ne glede na vrsto odvzetega vzorca se genetski material nahaja na vati, v raztopini za izpiranje ali v kapljici krvi. Ta vzorčni material se pošlje v laboratorij, kjer se izolira in očisti.

PCR test nato razdelimo v dva koraka:

• PCR: V tem koraku se količina prvotnega genskega materiala pomnoži.
• Elektroforeza: V drugem koraku se segmenti genoma "razvrstijo" glede na velikost. Tako lahko vzorec opišemo - določimo fino strukturo genskega materiala.

1. korak: PCR - "verižna reakcija s polimerazo"

"PCR" je prvi od dveh delovnih korakov: tu se količina obstoječe izhodiščne DNK pomnoži. Ker ga je mogoče pregledati le, če je genski material na voljo v zadostni količini. Večinoma je to človeška DNK; testi na koronavirus so torej virusna RNA.

Kratica PCR pomeni angleški izraz "Polymerase Chain Reaction".

Kaj je potrebno za PCR?

Začetna DNK se nahaja v reakcijski posodi s posebnimi snovmi. Obstoječi genetski material služi kot predloga, ki se kopira v prisotnosti določenih encimov (Taq polimeraze) in nekaterih osnovnih gradnikov DNK.

Postopek kopiranja poteka v več ponavljajočih se ciklih (ciklih).

Natančneje, združujejo se naslednje snovi:

• Začetna DNK: vzorec materiala, ki ga je treba ponoviti.
• Osnovni gradniki DNK: To so nukleobaze adenin, timin, citozin in gvanin.
• DNA polimeraza: encim, ki povezuje posamezne gradnike DNK in tvori dobro opredeljeno verigo DNK. Novo pridobljeni pramen je zrcalna (komplementarna) podoba izvirnega izhodnega materiala.
• Puferska raztopina: Polimerazna verižna reakcija poteka v fiziološki puferski raztopini. To zagotavlja pogoje, podobne tistim v človeških celicah. Ta raztopina ohranja stabilen pH in vsebuje tudi magnezijeve ione. Ti nadzorovani pogoji so potrebni za zagotovitev funkcionalnosti DNA polimeraze.
• Temeljni premazi: Sestavljeni so iz 16 do 24 osnovnih baz in služijo kot začetni položaj in signal za zagon. Primeri prikazujejo DNA polimerazo, na kateri se (začetne DNA) začne postopek kopiranja.

Kako se opravi PCR test?

Ker so vse snovi, potrebne za PCR, zdaj v reakcijski posodi, se lahko začne postopek kopiranja genskega materiala. To se šele zažene, nadzira in spet ustavi s temperaturo.

Reakcijsko posodo se posledično segreje ali ciljno ohladi na različne temperature. To se naredi s posebno napravo - tako imenovanim termičnim kolescem. Celotna reakcija traja približno eno do dve uri.

Posamezni koraki cikla PCR so:

• Denaturacija dvojnih verig DNK: Vzorec segrejemo na okoli 90 stopinj Celzija. Posledično se prvotna dvojna veriga DNK zlomi v dve ločeni (komplementarni) enojni verigi.
• Pritrditev temeljnega premaza: Temperaturo znižamo na nekoliko pod 60 stopinj Celzija. Posledično se primerji (začetni premazi, obratni primerji) pritrdijo na določene položaje na ustreznih posameznih verigah DNK.
• Podaljšek: Temperatura se dvigne na nekoliko nad 70 stopinj Celzija. DNA polimeraza zdaj začne delovati pri tem temperaturnem optimumu. Pritrdi se na položaje primerja in podaljša prvotno eno verigo DNA korak za korakom, dokler ni na voljo natančna (komplementarna) kopija (sinteza DNA).

Po končanem ciklu se temperatura ponovno zviša na okoli 90 stopinj Celzija - cikel se začne znova.

Z uporabo metode PCR lahko zaporedja DNA repliciramo do približno treh parov kilobaz (kbp). To ustreza približno 3000 osnovnim gradnikom DNK, ki so povezani v "verigo". Za primerjavo: človeški genom shrani načrte in informacije za delovanje celice v približno treh milijardah baznih parov - po drugi strani genom koronavirusa sestavlja 30.000 parov baz. PCR test se lahko uporablja samo za razmnoževanje in pregled kratkih odsekov celotne DNK.

Temeljni premazi so ključnega pomena

Izbira temeljnih premazov je ključnega pomena za postopek PCR. V diagnostiki Sars-CoV-2 se na primer uporablja več primerjev (multipleks PCR).

Koronski testi PCR iščejo tri različne gene virusa: Splošna specifičnost se poveča na skoraj 99,99%. To pomeni, da je pri tej visoki stopnji zadetkov le en lažno pozitiven test na 10.000 preiskav (če je vzorec pravilno odvzet).

Koliko kopiranega genetskega materiala je zdaj?

Predpostavimo, da po prvem ciklu obstajata dve enaki dvojni verigi DNK.

Po vsakem ciklu se količina (kopiranega) genskega materiala podvoji. Tako količina DNA raste eksponentno.

Z drugimi besedami: po drugem ciklu so štirje enaki dvojni prameni - po tretjem ciklu osem dvojnih pramenov - po četrtem ciklu 16 dvojnih niti in po petem ciklu že 32 dvojnih pramenov.

Zdravstveni delavci običajno ta postopek ponovijo približno dvajset do tridesetkrat.

Metaforično gledano to pomeni: Tudi če je bila v vzorcu na začetku najdena samo ena dvojna veriga DNK, bo po dvajsetih ciklih v reakcijski posodi že milijon enakih kopij.

Kaj pomeni vrednost Ct?

Število zaključenih ciklov PCR je podano v obliki tako imenovane vrednosti Ct. "Ct" izhaja iz angleškega izraza "prag cikla". Ta vrednost Ct omogoča podajanje trditev o količini iskanega genskega materiala.

Pri nizki vrednosti Ct 20 je veliko začetnega genskega materiala. Če pa je vrednost Ct visoka - okoli 30 ciklov - je ustrezno malo DNK. Zato je treba cikel PCR pogosteje izvajati.

2. korak: Elektroforeza "Razvrščanje po velikosti"

Nazadnje, če je dovolj "obogatenega" genskega materiala, lahko pride do elektroforeze. Znanstveniki uporabljajo določeno lastnost DNK: njen električni naboj.

Posamezni gradniki DNK so med seboj povezani preko (negativno) nabite hrbtenice sladkornega fosfata. Dlje ko je določeno zaporedje DNK, večji je njegov električni naboj.

Če genski material damo v določen nosilec (agarozo) in uporabimo električno napetost, se segmenti DNA zaradi naboja začnejo premikati. Ker daljši odsek DNK potuje hitreje kot krajši fragment, se ločijo glede na velikost.

Na ta način je mogoče pregledati in opredeliti genetski material. V praksi se neznani vzorec z znano referenco običajno nanese na "začetno črto" in se po določenem časovnem obdobju primerja med seboj.

Če je "hitrost selitve" za obe sekvenci enaka, to pomeni: Odkritje je zelo verjetno pozitivno - gen, ki ga iščete, je v vzorcu.

Poseben primer koronavirusa: priprava vzorcev in RT-PCR

Odkrivanje patogena za koronavirus je poseben primer. Sars-CoV-2 je eden od tako imenovanih virusov RNA. To pomeni, da je genom Sars-CoV-2 v obliki RNA (ribonukleinske kisline).

RNA se od DNA razlikuje le v nekaj pogledih. Med drugim je na voljo kot enojna veriga in temelji na sladkorni ribozi namesto na 2 "deoksiribozi. Nukleobazo timin je kot četrto bazo nadomestil tudi uracil.

To virusno RNA je treba pred običajnim testom PCR "prepisati" v DNK. Ta proces se imenuje reverzna transkripcija (RT) - od tod tudi izraz RT -PCR. Med tem postopkom dobimo eno verigo cDNA ("komplementarna DNA"). V naslednjem koraku je enojna veriga cDNA dopolnjena z drugo, zrcalno obrnjeno verigo DNA.

Na koncu priprave vzorca je dvojna veriga DNK, ki ustreza prvotnemu načrtu virusne RNA: Le ta dvojna veriga se lahko zdaj uporabi kot predloga pri PCR testu.

Koliko časa traja, da dobimo rezultat?

Po pošiljanju vzorca v laboratorij običajno dobite rezultat po enem ali dveh delovnih dneh.V preskusnih centrih, ki pogosto pregledajo vzorce na kraju samem, lahko to traja le nekaj ur. Časovno obdobje je v veliki meri odvisno od ustreznega preskusnega centra in njegove logistike.

Kljub zapletenim delovnim procesom lahko sodobni laboratoriji izvajajo PCR teste z visoko prepustnostjo. Pri izvajanju pomagajo posebne avtomatizirane naprave.

Test PCR se še vedno šteje za razmeroma "počasen", a vseeno bolj zanesljiv način odkrivanja.

Kaj se zgodi, če je rezultat pozitiven?

Če je vzorec pravilno odvzet, pozitiven test PCR pomeni, da je testirana oseba zelo verjetno okužena s Sars-CoV-2.

Če ste s testom PCR potrdili, da ste okuženi s koronavirusom, bo zdravstveni oddelek iz ustreznega laboratorija prejel sporočilo o pozitivnem rezultatu testa. V tem primeru bo zdravstvena služba odredila izolacijo ali karanteno.

Ali sem samodejno nalezljiv, če dobim pozitiven test PCR?

Večino časa da. Ampak ne vedno. Rezultat PCR testa je treba vedno razlagati v kontekstu. Pozitiven test v prvi vrsti pomeni, da imate v sebi virusni material.

Če ste pred kratkim preboleli Covid 19 (nekaj dni), je lahko PCR test še vedno pozitiven - čeprav ste že spet zdravi. To je poseben primer in slaba stran zelo občutljivega testa, saj lahko zazna tudi delce virusa, ki se ne morejo razmnoževati.

Dodatni test protiteles je včasih koristen

V takih primerih test protiteles zagotavlja gotovost, ki zagotavlja veljavnost testa PCR. Najbolje je, da se o tem pogovorite s svojim zdravnikom. Lahko vam pomagajo pravilno interpretirati rezultat testa PCR.

Kaj storiti, če je rezultat negativen

Negativni rezultat testa PCR z veliko verjetnostjo pomeni, da niste odkrili Covid-19, ko ste odvzeli vzorec, in zato trenutno niste nalezljivi. Lahko pa ste v zgodnjih fazah okužbe.

Običajno je mogoče okužbe s korono odkriti šele drugi ali tretji dan po okužbi. Rezultat torej ni brezplačna vstopnica. Zato morate še naprej upoštevati razdaljo in higienska pravila ter še naprej nositi masko FFP2 - zase in za zaščito drugih.

PCR test pri otrocih

Pediatrični test PCR se ne razlikuje od testa PCR pri odraslih. Tako vzorčenje kot interpretacija rezultatov veljata tako za otroke kot za odrasle.

Kakšna so tveganja PCR testa?

PCR test ne predstavlja fizičnega tveganja. Le vzorčenje z brisom iz nazofarinksa nekateri ljudje dojemajo kot nadležno ali neprijetno.

Koliko stane PCR test?

Vsi stroški, ki nastanejo pri testiranju PCR, bodo pokriti, če zdravniki ali zdravstvena služba takšen test odobrijo. Povračilo stroškov se običajno upošteva, če že imate lastne simptome ali ste imeli neposreden stik z okuženimi ljudmi.

Tudi v primeru pozitivnega hitrega ali samopreizkusa ste upravičeni do brezplačnega testa PCR.

Opomba: Če ste se testirali doma in ste dobili pozitiven rezultat, se morate nemudoma dogovoriti za sestanek z družinskim zdravnikom po telefonu. Vaš zdravnik se bo z vami po telefonu pogovoril o nadaljnjem postopku.

Druga možnost je, da pokličete številko 116 117, da se prijavite za test PCR. Do potrditvenega testa bi morali ostati doma, da zaščitite sebe in druge.

Tags.:  droge intervju potovalna medicina